當(dāng)人們提到所謂的使能技術(shù)（enablingtechnologies），類似印刷機的發(fā)明，或者麻醉藥的發(fā)現(xiàn)就會浮現(xiàn)在我們腦海中。而對于科學(xué)家來說，CRISPR-Cas9系統(tǒng)就是這樣一種系統(tǒng)。

這種細菌免疫系統(tǒng)能通過將病毒DNA中的短重復(fù)片段整合到細菌基因組中，來抵抗病毒。當(dāng)細菌（或其后代）第二次感染病毒的時候，這些重復(fù)序列就能通過一種核酸酶靶向侵入的互補DNA，并摧毀它。

幾個研究組就利用了這一系統(tǒng)編輯真核生物基因，隨后看到在不少應(yīng)用中CRISPRs迅速崛起，多個不同物種都實現(xiàn)了基因組中基因刪除和插入，激活或抑制基因轉(zhuǎn)錄。但是隨著這一系統(tǒng)越來越受歡迎，關(guān)于其特異性和有效性的質(zhì)疑也越來越多。

如何提高導(dǎo)向RNA（gRNA）的特異性是一大問題，這種RNA能將Cas9核酸酶帶領(lǐng)到基因組目標位置，NatureBiotechnology雜志建議切斷gRNAs(Nature子刊：巧解基因編輯脫靶問題)，減少脫靶問題，而且不影響靶標活性，而另外一個研究組則建議更長一些的gRNAs(Analysisofoff-targeteffectsofCRISPR/Cas-derivedRNA-guidedendonucleasesandnickases)。

這明顯是有些自相矛盾的建議，前者的研究人員指出只是簡單截短了gRNA靶標區(qū)域的長度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在之前檢測到的脫靶位點，脫靶突變都大幅減少，與全長gRNA相比，一些位點的突變頻率甚至減少了5,000倍以上。重要的是在靶向它們的預(yù)定目標DNA時，這些縮短了的gRNA（稱為tru-gRNA）與全長gRNA同樣有效。而后者則發(fā)現(xiàn)選擇合適的靶標序列，優(yōu)化gRNA和Cas9，就能避免或者減少脫靶突變的出現(xiàn)。

另外一個問題是如何篩選脫靶，以及中對于研究的影響有多少。可以驗證gRNAs錯配候選位點的方法也許會錯失一些關(guān)鍵的剪切位點，而且全基因組測序也不是非常有效，目前我們需要一種敏感且無偏差的方法，來標記Cas9靶標位點，并令它們能在整個基因組中被識別出來。

其它的令這一系統(tǒng)特異性更強的方法還有，用配對替換切口酶（nickases）替換Cas9核酸酶（前者每次只能切斷DNA一條鏈），或者將Cas9突變?nèi)诤系紽ok1這種需要催化激活的核酸酶中去。此外，通過來自不同物種的Cas9也能增加靶向多個位點的靈活性，進一步改善Cas9-gRNA復(fù)合物的傳遞系統(tǒng)，也有助于增加效率。

盡管Cas9潛力無限，但是這還是一種細菌的蛋白，對于一些應(yīng)用，尤其是臨床上的應(yīng)用來說，還需要尋找真核生物核酸酶進行替換。對于植物來說，一些Argonaute核酸酶能通過小RNAs靶向DNA，這也是基因組編輯可以考慮的一個方向。

本文來自：逍遙右腦記憶 http://www.simonabridal.com/gaozhong/763425.html

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